1.2 药材与试剂
实验用对照品咖啡酸（批号120160505）、肉桂酸（批号20091329）、桂皮醛（批号21051103）、槲皮素（批号10081-9905）、6-姜辣素（批号20041903）、姜黄素（批号151022）、黄芪甲苷（批号21050701）、甘草苷（批号20091106）、甘草酸（批号20041302）、毛蕊异黄酮苷（批号21010901）、人参皂苷Rg1（批号20110810）、人参皂苷Rb1（批号21011625）、人参皂苷Rf（批号21071411）、人参皂苷Re（批号21012405）、人参皂苷F1（批号O0915AS）购自北京倍特仁康生物医药科技有限公司，对照品质量分数均＞98%。乙腈、甲醇、甲酸（美国Fisher公司）均为质谱纯；水为屈臣氏饮用水；其他试剂均为分析纯。
人参（批号RS220311）、黄芪（批号HQ220402）、甘草（批号GC220406）、肉桂（批号RG220315）、生姜（批号SJY501-21-10-004），购于江苏万邦生化医药公司，均来源于道地产区或主产区，经中国中医科学院中药研究所孙奕研究员鉴定，5味药材分别为五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey. 的干燥根和根茎，豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎，樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl的干燥树皮，姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鲜根茎。
1.3 动物
SD大鼠，SPF级，雄性，体质量200～300 g，动物来源机构许可证号：SCXK（京）2021-0011或者SCXK（京）2021-0006；饲养于中国中医科学院中药研究所SPF级动物房，动物实验伦理审批单位为中国中医科学院中药研究所，批准文号2022B023。
2 方法
2.1 分析溶液的制备
2.1.1 保元汤水提液化学成分分析
（1）保元汤水提液制备：分别取3倍处方剂量药材饮片人参11.2 g、黄芪22.4 g、甘草5.6 g、肉桂2.3 g、生姜片约9.0 g，加水1200 mL，浸泡60 min，以武火煮沸后转文火继续煎煮至480 mL，多层纱布趁热滤过，取续滤液；药渣再加水900 mL，煎煮至420 mL，多层纱布趁热滤过，取续滤液，合并2次滤液，得提取液。将少量提取液经0.22 μm滤膜滤过，取2 μL液质分析。
（2）对照品溶液制备：精密称取各对照品约1.0 mg，精密称定，加入甲醇配制成1.0 mg/mL的单一对照品储备液。从上述各单一对照品储备液中精密量取储备液各100 μL，加入甲醇稀释，配制成质量浓度为0.05 mg/mL的混合对照品溶液。
2.1.2保元汤入血成分分析
（1）保元汤ig液制备：称取保元汤水提液冻干粉末，加适量饮用水配制成0.14 g/mL的ig受试液。
（2）血浆样品采集与处理：经预试验，确定动物给药及采血方案：6只SD雄性大鼠，分为给药组与空白组，每组3只，给药前禁食12 h，自由饮水，保元汤2倍临床等效剂量ig给药（1.41 g/kg），给药容积1 mL/100 g，空白组给予同等体积的蒸馏水，每天给药2次，连续给药1周，1周后戊巴比妥钠麻醉，腹腔主动脉取血，肝素管抗凝，静置，4 ℃，3500 r/min，离心15 min，取上清液则为含药血浆[9]。
取含药血浆样品200 μL，加入甲醇800 μL沉淀蛋白，涡旋5 min，离心（转速13 000 r/min，15 min，取上清，氮气吹干，备用。固相萃取柱活化，取氮气吹干后样品加0.5 mL水溶解，涡旋2 min后上样，以5 mL水洗脱，收集洗脱液，再用5 mL的70%甲醇洗脱，收集2种洗脱液，将水洗脱液和甲醇洗脱液13 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，70%甲醇洗脱液经氮气吹干，100 μL 70%甲醇复溶，经0.22 μm滤膜滤过，得血浆样品进行分析。空白血浆处理方法同上。
2.2 UPLC-MS/MS条件
2.2.1色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS-T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～3 min，2%～19% B；3～8 min，19% B；8～8.1 min，19%～22% B；8.1～14 min，22%～29% B；14～16 min，29% B；16～32 min，29%～45% B，32～32.1 min，45%～90% B，32.1～35 min，90%～95% B，35～36 min，95% B，36～40 min，95%～2% B；体积流量0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样量2 μL。
2.2.2质谱条件采用电喷雾离子源（ESI），扫描方式为MSe模式，正、负离子模式下离子源工作参数为毛细管电压3.0 kV，锥孔电压30 V，锥孔反吹气流量（N2）50 L/h，脱溶剂气流量1000 L/h，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度450 ℃，扫描范围m/z 50～1500，数据分析采用UNIFITM 1.9.4质谱分析软件进行数据采集分析。
2.3 化合物鉴别与结构分析
采用UNIFITM1.9.4质谱分析软件进行数据采集和分析，通过Chemspider数据库、chemical book数据库、本课题组化学成分实验数据库以及结合可参考文献数据，建立包含保元汤5味药材化学成分的质谱内部数据库，通过精确相对分子质量、离子碎片信息以及对照品比对鉴定化合物，并按照化合物结构类型进行总结归纳；入血成分的鉴定方法同上，给药后血浆与方剂提取液离子峰的保留时间、质荷比一致的化合物，则确认为保元汤中的入血成分，并对其中特征成分的代谢产物进行鉴别。
2.4 网络药理学分析
2.4.1保元汤潜在作用靶点将经UPLC-QTOF- MS/MS分析鉴定后的保元汤入血原型成分，通过TCMSP数据库和药物信息数据库Drug Bank（http://www.drugbank.ca/）找到与之对应的靶蛋白。
2.4.2网络构建在Uniprot数据库中查找靶点蛋白对应的基因名称和编号，将活性成分及相关靶点基因名导入网络可视化软件Cytoscape 3.8.2，运用Cytoscape软件构建保元汤入血活性成分-靶点网络。通过网络将活性入血成分与作用靶点相关联，实现从保元汤主要入血成分到作用靶点分析，通过String数据库对相应的靶点绘制蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图，通过节点度（degree）值与combined score值大小筛选核心靶点。
2.4.3数据分析处理与疾病预测构建的“成分-靶点”网络图，运用Cytoscape软件中的工具Network Analyzer来分析中介中心度（betweenness centrality）和节点度这2个重要的网络拓扑参数；利用Metascape数据库对获得的靶基因进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。Bonferroni法校正后P＜0.01的项目被认为是显著富集，故根据P＜0.01，进行筛选相关的生物过程（biology process，BP）、细胞组成（cellular componet，CC）、分子功能（molecular function，MF）以及KEGG富集后的主要通路。最后，将KEGG信号通路经FDR筛选，输入CTD数据库进行疾病预测。
3 结果
3.1 保元汤水提液化学成分鉴定
通过文献综述等方法整理出人参、黄芪、甘草、肉桂、生姜5味中药化学成分，得到保元汤主要化学成分389种[10-11]，其中人参75种、黄芪109种、甘草162种、肉桂43种、生姜67种。通过Chemspider数据库和Chemical Book数据库下载保元汤主要化学成分mol格式文件，在UNIFITM1.9.4中建立了包含215种化学成分的内部数据库。对UPLC-QTOF- MS/MS的采集数据对库，结合本课题组内部数据库及文献中质谱裂解规律及对照品比对共鉴别出133个成分，保元汤水提液正、负离子模式下的总离子流图及成分归属见图1，保元汤水提液化学成分见表1，主要化学成分为皂苷和黄酮类。典型化合物质谱裂解规律如下，（1）皂苷类：化合物83（tR＝22.85 min）在负离子模式下检测得到准分子离子峰为m/z1 153.60[M＋HCOO]−, 1 107.598 4 [M－H]−，其二级质谱图（图2-B）上可看到碎片离子m/z 945.544 5[M－H－Glc]−, 783.491 7 [M－H－GlcGlc]−, 621.438 5 [M－H－GlcGlcGlc]−，经查阅文献，并与对照品比较，推断化合物83为人参皂苷Rb1。化合物53（tR＝13.08 min）准分子离子峰为m/z799.486 0 [M－H]−, 845.491 9[M＋HCOO]−, 637.433 1 [M－H－Glc]−, 475.379 7 [M－H－GlcGlc]−，经查阅文献，并与对照品比较，推断53为人参皂苷Rg1（图2-A）。通过以上规律可以得出皂苷的裂解以糖苷键的断裂为主，类似的化合物54被推断为Re，其余化合物类比鉴别。（2）黄酮类：化合物35（tR＝7.34 min）准分子离子峰为m/z 417.119 4 [M－H]−，其二级质谱图上可见碎片离子m/z255.066 7 [M－H－Glc]−, 135.008 6, 119.049 9，结合文献，糖苷键的断裂和RDA裂解是黄酮类化合物的主要质谱裂解规律，故推测135.008 6 [1, 3A]−, 119.049 9 [1, 3B]−，与对照品比对，推断35为甘草苷（图2-C），其余化合物依次类推得出。
3.2 保元汤水提液主要入血化学成分鉴定
前项研究已得保元汤水提液化合物鉴定结果，由于水提液化合物鉴别方法的色谱条件、质谱条件等与大鼠含药血浆中入血成分鉴定方法一致，因此保元汤水提液化合物保留时间及特征离子与血浆中入血成分数据也高度一致，以保元汤水提液中化合物信息为基准，构建“保元汤入血成分数据库”，采用UNIFITM1.9.4进行数据匹配，对保元汤的入血成分进行识别（图3），共鉴定出35个入血成分（表2），其中包括9个皂苷类、14个黄酮类、4个有机酸，8个其他类成分，对其中代表性成分中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、人参皂苷Rb1、甘草酸进行代谢产物鉴定，鉴定结果见表3。
3.3 基于网络药理学的功效物质及其靶点预测
通过TCMSP数据库和Drug bank数据库检索并与文献比对，保元汤35个入血原型成分中共有27个入血成分能得到对应的靶点，共有193个对应作用靶点。通过Uniprot进行基因名称的转化，利用Cytoscape构建出“成分-靶点”网络图（图4），betweenness centrality和degree均大于平均值的主要成分有人参皂苷Rb1、丹皮酚、大豆异黄酮、刺甘草查耳酮、6-姜辣素、甘草查耳酮A、刺芒柄花素、水杨酸（表4）。利用String数据构建PPI网络图（图5），根据degree以及combined score筛选关键靶点，主要靶点分别为E1结合蛋白P300（E1A binding protein p300，EP300）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、肿瘤蛋白p53（tumor protein P53，TP53）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase，AKT1）、信号转导子和转录激活子3（signal transducer and activator of tranion 3，STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、人磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚基1（phosphatidylinositol-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）、环腺苷3′,5′-单磷酸反应元件结合蛋白1（cyclic adenosine 3',5'-monophosphate responsive element binding protein 1，CREB1）、雄激素受体（androgen receptor，AR）、周期素依赖性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）。
3.4 GO功能与KEGG通路富集分析
利用Metascape在线数据库对预测靶点进行GO和KEGG富集分析，筛选出P＜0.01的GO条目346个，其中BP 199个，CC 56个及MF 91个。BP主要有对激素的反应（response to hormone）、对异生素刺激的反应（response to xenobioti stimulus）、对缺氧的反应（response to hypoxia）、凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process）、对氧化应激反应（response to oxidative stress）等，CC主要涉及到膜筏（membrane raft）、胞膜小窝（caveola）、膜微区（membrane microdomain）、神经元细胞体（neuronal cell body）、突触后膜（postsynaptic membrane）等；MF主要有酶结合（enzyme binding）、蛋白质结合（protein binding）、蛋白质异二聚化活性（protein heterodimerization activity）等分子功能。各取前20位制作富集气泡图，见图6。
通过KEGG富集分析得到信号通路，根据P＜0.01筛选，共得到187条通路，其中主要涉及到糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGE）-糖基化终末产物受体信号（receptor for advanced glycation end products，RAGE）通路（AGE-RAGE signaling pathway）、脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、表皮生长因子-酪氨酸激酶抑制剂抵抗（epidermal growth factor receptor，EGFR-tyrosine kinase inhibitor resistance）、雌激素信号通路（estrogen signaling pathway）、缺氧诱导因子信号通路（hypoxia inducible factor-1，HIF-1 signalingpathway）、松弛素信号通路（relaxin signaling pathway）、白介素-17信号通路（interleukin-17，IL-17 signaling pathway）、Janus激酶-信号转导子和转录激活子（Janus kinase，JAK；signal transducer and activator of tranion，STAT）（JAK-STAT signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、环鸟苷单磷酸蛋白激酶信号通路（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG signaling pathway）、血管内皮生长因子信号通路（VEGF signaling pathway）、环核苷酸信号通路（cAMP signaling pathway）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）等信号通路。每条通路富集多个基因，体现了保元汤在治疗疾病过程中多靶点、多通路的作用特点。以基因富集数目多，P值大小为选择依据，选取前20个通路制作富集气泡图见图7。
3.5疾病预测
将上述String数据库得到的KEGG信号通路再经FDR值小于0.001筛选后得到的前5条信号通路（hsa04933：AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，hsa05200：pathways in cancer，hsa05215：prostate cancer，hsa05417：lipid and atherosclerosis，hsa05161：hepatitis B）输入到CTD数据库进行疾病预测，共得到284种疾病，从中筛选均涉及上述5个通路的疾病共有24种：心脏衰竭、心肌病、心肌炎、心肌梗死、心肌缺血、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、阿尔茨海默症、再灌注损伤、绝经后骨质疏松症、乙型肝炎、关节炎、类风湿、急性肾损伤、肺纤维化、哮喘、动脉粥样硬化、肝硬化、2型糖尿病、结直肠癌、高血压、脑缺血、黑色素瘤。
4 讨论
课题组在前期的血浆前处理中，以检测到物质最多为标准，比较了乙腈、甲醇、异丙醇沉淀以及样品的处理方法，最终确定血浆样品前处理选择4倍量甲醇沉淀蛋白，再过固相萃取小柱富集、除杂，以70%甲醇复溶后液质进样分析为最佳方案。
综合各种可参考文献数据可知，保元汤原药材含有至少389个化学成分。运用高分辨质谱分析技术，从保元汤水提液中共鉴定得到133个化合物。
本实验制备的保元汤水提液符合临床使用实际，故对保元汤进行药效物质基础分析时，基于实验所得133个化合物更有针对性。
经多次多天大鼠ig给药后，发现保元汤有35个原型成分可以被吸收入血在体循环中稳态分布，并且在大鼠含药血浆成分检测中，包含35种原型成分在内共鉴别了43个化合物，药物吸收入血后会代谢转化成代谢产物等物质，共鉴别14个代谢产物，其中有6个既是原型成分，也是代谢产物，分别为毛蕊异黄酮、大豆异黄酮、甘草素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、18β-甘草次酸；其余8个化合物为原型成分的代谢产物，因而推测其主要成分的代谢类型有葡萄糖基水解、葡萄糖醛酸水解、葡萄糖醛酸化、氢化、硫酸化、甲酯化等过程。本实验以入血的原型成分作为保元汤在体内的药效物质基础，故以鉴别出的35个原型成分为基准。
保元汤可通过人参皂苷Rb1、丹皮酚、大豆异黄酮、刺甘草查耳酮、6-姜辣素、甘草查耳酮A、刺芒柄花素、水杨酸等8个关键成分作用于EP300、MAPK1、TP53、AKT1、RELA、STAT3、MAPK14、PIK3R1、TNF、CREB1、AR、CDKN1A等核心靶点，通过AGE-RAGE、EGFR、JAK-STAT、cGMP-PKG、cAMP、PI3K-Akt信号通路等多种途径发挥药效作用，推测保元汤除治疗慢性心力衰竭外，还对阿尔茨海默症、再灌注损伤、绝经后骨质疏松症等具有潜在治疗优势。更值得一提的是，本课题组在化合物靶点和通路等靶标分析时，发现多种化学成分中既有单一成分对接多个靶点、又有多个类似同类成分对接同一靶点的情况，由此可佐证“中药（复方）多成分多靶点协同作用”理论与“中药多成分单靶点叠加作用”假说。中药复方能从多途径、多靶点、多层次、多系统的对疾病进行干预，突显了中药复方治疗疾病的潜力和优势，即中药（复方）具备“多成分多靶点协同作用”特征。蔡少青等[26-27]提出中药“多成分单靶点叠加作用”假说，认为中药多成分多靶点协同作用网络中局部靶点可存在相似多成分的药效叠加作用。
保元汤药效物质关联治疗的潜能分析。保元汤作为临床上常用的经典名方，对心血管系统疾病，如慢性心力衰竭、扩张型心肌病[28]、心肌炎、心绞痛等具有良好的效果[29-30]。通过多通路靶点发挥治疗作用，慢性心力衰竭发病与VEGF、TNF-α、IL-6等炎症因子的表达[31]以及MAPK、JAK-STAT、NF-κB等信号通路[32]相关；扩张型心肌病的发病与MAPKs、PI3K-Akt、cGMP-PKG等通路密切相关。上述两种疾病涉及到的信号通路与文章通过GO和KEGG功能富集得到保元汤作用主要信号通路AGE-RAGE、EGFR、JAK-STAT、cGMP-PKG、cAMP、PI3K-Akt等信号通路均相对应，推测保元汤可能通过细胞质、细胞膜、内质网等细胞组分调节PI3K-Akt、MAPK、AGE-RAGE、TNF等通路发挥抑制炎症反应、抗氧化、抑制细胞凋亡等作用。
本实验所提示的保元汤潜在治疗优势病种除传统治疗心衰外，还有23种预测疾病。“化合物-靶点”网络分析结果显示，保元汤中人参皂苷Rb1、丹皮酚、大豆异黄酮、刺甘草查耳酮、6-姜辣素、甘草查耳酮A、刺芒柄花素、水杨酸等8个成分的潜在作用靶点较多，推测它们在保元汤对疾病的治疗中发挥重要作用。有研究表明人参代表性成分人参皂苷Rb1能显著降低心肌梗死面积，可能是通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶磷酸化、激活mTOR信号通路和调控线粒体功能实现；人参皂苷Rb1同时有治疗阿尔茨海默病症的潜力，人参皂苷Rb1通过改变β-淀粉样前体蛋白裂解途径，减少Aβ的生成，抑制Aβ诱导的神经毒性反应；通过抑制细胞凋亡因子Bax、Caspase-3表达，激活抗细胞凋亡因子Bcl-2，保护神经元细胞从而改善痴呆鼠的认知功能[33]，臣药黄芪中主要活性成分皂苷和黄酮类，已有临床研究证明[34]，黄芪能通过抑制氧化应激的激活与扩散，减轻心肌损伤，从而起到保护心肌的作用。黄芪中芒柄花素能通过抑制ERK1/2、p38及NF-κB磷酸化，诱导细胞凋亡；还可通过PGC-1α通路、NF-NRF-2/HO-1通路抑制高脂血症诱导的炎症，改善认知功能[35]。毛蕊异黄素可通过调节PI3K/Akt信号通路及Bcl-2、Bax，增加H9c2细胞的细胞活性，并通过抑制氧化应激及细胞凋亡改善阿霉素诱导的心脏毒性[36]。甘草中活性成分大豆苷元能通过活化ERα对MG-63细胞IL-6的表达起抑制作用[37]，IL-6是骨代谢过程中重要的调节因子，与雌激素缺乏导致的骨丢失密切相关，妇女绝经后骨质疏松症的发生，很可能是由于患者的雌激素下降致使IL-6分泌水平升高[38]。通过GO功能和KEGG富集结果显示雌激素信号通路也是保元汤作用主要信号通路之一。也有研究表明大豆苷元有防治阿尔茨海默症的作用及其抑制Aβ神经毒性发挥神经保护作用[39]。此外，甘草查耳酮A抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化并促进乳腺癌细胞自噬[40]；刺甘草查耳酮能通过抑制NLRP3炎症小体的异常活化从而治疗多种炎症性疾病[41]。研究发现[42]6-姜酚能够通过抑制细胞内PDE4蛋白表达而抑制环磷腺苷水解，升高细胞内cAMP含量，从而发挥其抗炎作用。
综上所述，结合疾病预测结果，发现保元汤除了对临床常规治疗疾病心脏衰竭、心肌病、心肌炎、心肌梗塞、心肌缺血等心血管疾病外，还对阿尔茨海默症、再灌注损伤、绝经后骨质疏松症、多种炎症疾病等具有治疗潜力。
因此，本研究基于UPLC-QTOF-MS/MS技术，明确鉴定了保元汤水提液中133个化合物，其中，皂苷类54个、黄酮33个、生物碱4个、有机酸17个、其他类25个；鉴定到入血成分35个，代谢产物8个，并结合网络药理学等方法对保元汤入血原型成分的主要作用靶点及分子水平作用机制进行探讨，预测了12个关键靶标基因，8个主要入血药效活性成分，发现保元汤药效分子机制主要涉及炎症相关通路、氧化应激等方面，对阿尔茨海默症、再灌注损伤、绝经后骨质疏松症、多种炎症疾病有治疗潜力，本次研究可为保元汤质量标准、质量标志物、扩大临床适应症等研究提供参考，进一步拓展保元汤的临床应用，也可以为古代经典名方的现代开发应用提供研究方法学借鉴。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：李淑慧，王 雅，田 军，郭雨轩，张淑涵，牟 越，翁小刚，孙 奕．古代经典名方保元汤的药效物质基础及其分子水平机制的研究 [J]. 中草药, 2023, 54(21): 6971-6987.返回搜狐，查看更多